En 1965, il fait ses débuts à Broadway dans The Impossible Years. En 1966, il rejoint la classe d'acteurs de George Morrisson (le célèbre George Morrison Studio) et intègre le fameux Actors Studio.

Après des passages dans des séries télévisées et au théâtre, le réalisateur James Bridges lui offre son premier rôle au cinéma dans The Baby Maker en 1970. Il s'installe à Los Angeles, mais n'apprécie pas du tout la vie californienne.

Bien qu'il côtoie ensuite de grands réalisateurs comme Robert Altman (Nashville, 1975) ou Francis Ford Coppola (Apocalypse Now, 1979), sa carrière ne démarre pas vraiment. Pendant le tournage d'Apocalypse Now, il passe plusieurs semaines aux Philippines et s'intègre à la tribu des Ifugao. Dans le film de Coppola, il incarnait le capitaine Colby, envoyé par la CIA, avant le capitaine Villard, pour tuer le colonel Kurtz, mais qui se ralliera à sa cause . On ne le voit que en deux plans dans le film, dont un plan est visible lors de l'arrivée de Villard au camp de Kurtz. Dans le film, les scènes de Scott Glenn ne sont pas présentes, Coppola ayant choisi de ne pas les mettre dans le film, car les scènes étaient trop violentes, ou compromettantes pour l'image de la CIA, ou des états-Unis d' Amérique. Coppola présentera peut-être les scènes de Scott Glenn, si il décide de monter en série de plus de 5 heures pour la télévision, son film, Apocalypse Now, avec des scènes inédites avec Kurtz.

En 1978, il quitte la Californie et se retire avec sa famille dans l'Idaho. Il oublie le métier d'acteur et devient barman. Deux ans plus tard, James Bridges le recontacte pour le drame Urban Cowboy où il interprète Wes, le rival de John Travolta. Scott Glenn obtient alors la reconnaissance du public et de ses pairs.

Il multiplie alors les tournages et les genres : l'épouvante avec La Forteresse noire de Michael Mann (1983), le western avec Silverado de Lawrence Kasdan (1985) ou encore des drames comme L'Étoffe des héros de Philip Kaufman (1983) (où il incarne l'astronaute Alan Shepard) ou La Rivière de Mark Rydell (1984).

En 1987, Élie Chouraqui lui offre le premier rôle de son film Man on Fire. Le rôle sera repris par Denzel Washington dans le remake américain du même nom de Tony Scott, en 2004.

Au début des années 90, il joue dans de grosses productions comme À la poursuite d'Octobre Rouge de John McTiernan (1990) et surtout dans Le Silence des agneaux de Jonathan Demme (1991), où il incarne Jack Crawford, un profiler du FBI. Il continue dans le même registre avec Backdraft de Ron Howard (1991), Les Pleins Pouvoirs de Clint Eastwood (1997) et Vertical Limit de Martin Campbell (2000).

Souvent abonné aux seconds rôles, il alterne entre blockbusters et films indépendants : Virgin Suicides de Sofia Coppola (1999), Training Day d'Antoine Fuqua (2001), Écrire pour exister de Richard LaGravenese (2007), La Vengeance dans la peau de Paul Greengrass (2007).

En 2008, Oliver Stone lui confie le rôle de Donald Rumsfeld (secrétaire à la Défense de 2001 à 2006) pour W. : L'Improbable Président, film biographique sur l'ascension au pouvoir de George W. Bush, joué par Josh Brolin.français