Dylan O'Brien est né à New York, de Lisa Rhodes, une ancienne actrice qui dirigeait également une école d'art dramatique, et de Patrick B. O'Brien, un opérateur de caméra. Son père est d'origine irlandaise et sa mère est d'ascendance anglaise, espagnole et italienne. Dylan a grandi à Springfield Township, dans le comté d'Union, dans le New Jersey, avant de déménager avec sa famille à Hermosa Beach, en Californie, lorsqu'il avait 12 ans. Avant d'être piqué par le virus de la comédie, Dylan avait prévu de faire une école de cinéma et de devenir directeur de la photographie, comme son père. Mais une fois qu'il a décroché le rôle de Stiles, l'acolyte loufoque de Scott (Tyler Posey) dans Teen Wolf (2011), il a décidé de remettre l'école à plus tard (il était initialement pressenti pour le rôle de Scott, mais il était plus intéressé par celui de Stiles).

Dylan a développé un vaste public sur YouTube pour une série de courts métrages comiques en ligne qu'il a réalisés, produits et dans lesquels il a joué. Il a fait ses débuts au cinéma en étant l'une des vedettes du long métrage indépendant entièrement improvisé High Road (2011), réalisé par Upright Citizens Brigade. Le premier rôle principal d'O'Brien dans un film a été celui de Dave dans la comédie The First Time (2012), aux côtés de Britt Robertson et réalisée par Jonathan Kasdan. Il a ensuite tenu un second rôle, celui de Stuart, un expert en technologie, dans la comédie de Vince Vaughn/Owen Wilson The Internship (2013), et a été la tête d'affiche du film d'aventure fantastique The Maze Runner (2014), avec également Will Poulter et Kaya Scodelario, ainsi que de sa suite, Maze Runner : The Scorch Trials (2015) et le film final, The Death Cure (2018). Il a décroché le rôle de Stu dans le premier épisode de Weird City (2019) et a également obtenu le rôle de Sam Taylor dans le premier épisode d'Amazing stories (2020). Il a tourné deux autres films dans l'intervalle, Love and Monsters et Flashback. Il tourne actuellement "Not Okay", réalisé par Quinn Shephard, avec Zoey Deutch.