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Zusammen mit seiner Zwillingsschwester Ruth besuchte Macfarlane die London Central Secondary School in seiner Heimatstadt. Er war der Frontmann der im schulischen Umfeld gegründeten Band Fellow Nameless, die er aber verließ, um in der Drama Division der Juilliard School in New York City zu studieren. Er studierte dort mit einem vierjährigen Stipendium und graduierte schließlich 2003.

Seine erste Rolle in einem größeren Film bekam er 2004 in Kinsey – Die Wahrheit über Sex. Er spielte darin Bruce, den Sohn des Sexualforschers Alfred Kinsey. In der Fernsehserie Over There – Kommando Irak spielte er den Private Frank Dumphy. Von 2006 bis 2011 spielt er die Rolle des Scotty Wandell in der ABC-Serie Brothers & Sisters.

Seit 2014 verkörpert er den Rick Lincoln in der Krankenhausserie The Night Shift. Seit 2015 ist er in der kanadischen SF Serie Killjoys als "D'avin Jaqobis" zu sehen.

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